کلونینگ و تخلیص پروتئین s100a9 از نوتروفیل های پلاسمای انسان و تولید این پروتئین بصورت نوترکیب

چکیده پروتئین های s100، گروهی از پروتئین های سیتوپلاسمی چندژنی می باشند که به یون کلسیم ca2+ متصل می شوند. این پروتئین ها جزء پروتئین های اسیدی کوچک (10-12 کیلودالتونی) هستند که منحصرا در مهره-داران یافت می شوند. بیش از 40 سال پیش نخستین اعضای خانواده پروتئینی کشف و از مغز گاو تخلیص شد. علت نامگذاری این پروتئین به s100 حلالیت100% آنها در محلول سولفات آمونیوم می باشد. اغلب ژنـهای s100 دریک مجموعه ژنی در ناحیــه ای واقع در قطعه 21 بازوی بلند کروموزوم شماره یک ( 1q21 ) انسان قرار دارند. این ناحیه مسئول بسیاری از ناهنجاری های کروموزومی محسوب می شود. یکی از پروتین های خانواده s100 ، پروتئین s100a9 است که یک پروتیئن متصل شونده به یون کلسیم و دارای 113 اسید امینه با وزن مولکولی 13 کیلو دالتون می باشد. این پروتئین از فاگوسیت های فعال شده آزاد می شود و به طور مستقیم سلول های اندوتلیال و فاگوسیت های تک هسته ای و لنفوسیت ها را از طریق بر هم کنش با گیرنده rage و tlr- 4 فعال می کند. پروتئین s100a9 از جمله واسطه های مولکولی مهم در بسیاری از بیماریها از جمله آرتریت التهابی، تصلب شرایین و عفونتهای میکروبی می باشد. s100a8 و s100a9 چون دارای نقش دو گانه ای در خارج و داخل سلول دارند فعالیت خود را به صورت هترو دایمر s100a8/a9 انجام می دهند. هترو دایمر s100a8/a9 دارای عملکرد های ایمونولوژیکی متفاوتی است از جمله : در فعالیتهای وابسته به کلسیم در طی التهاب نقش مهمی دارد. این نقش شامل فعالسازی mac-1 و اینتگرین ?2 می باشد که در اتصال نوتروفیل به سلولهای پوششی شرکت می نماید. دراین تحقیق ، بعد از طراحی پرایمر برای ژن s100a9 ، واکنش pcr برای تکثیر این ژن انجام گرفت. بعد از آن محصول pcr در ناقل بیانی pet-28a+ کلون شد. ناقل نوترکیب به سویه باکتری e.coli bl21de3 انتقال یافته و به وسیله iptg القاء شد. بیان پروتیئن مذکور در سویه باکتری e.coli bl21de3 مورد ارزیابی قرار گرفت و به وسیله واکنش ایمونوبلاتینگ تایید شد. فرآیند بیان با تغییر 3 پارامتر اصلی ( زمان- دما- غلظت iptg) بهینه شد. بهینه سازی نشان داد که میزان بالایی از پروتیئن نوترکیب s100a9 بر روی ژل مشاهده می شود. بهترین شرایط بیان دردمای 37 درجه سانتی گراد ، مدت زمان 12ساعت بعد از غلظت mm /5 از iptg ایجاد می شود درنهایت پروتیئن نوترکیبs100a9 به وسیله ستون نیکل تخلیص شد. واژگان کلیدی : پروتئین s100a9 ، کلون کردن، بیان، تخلیص پروتئین